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潔凈廠房 | 菌種保藏-無菌檢驗、微生物限度檢驗

分類:
行業新聞
作者:
發布時間:
2019/11/05 15:07
菌種保藏是指保持微生物菌株的生活力和遺傳性狀的技術。
主要目的:把從自然界分離到的野生型,或經人工選育得到的變異型純種,使其存活、不丟失、不污染雜菌、不發生或少發生變異,保持菌種原有的各種特征和生理活性。
基本原理:使微生物的生命活動處于半永久性的休眠狀態,也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低范圍內。
主要措施:干燥、低溫和隔絕空氣。

一、菌種保藏步驟

1.挑選特征典型的純菌菌落。方法是用接種環挑取少許菌苔,接種至2ml營養肉湯或0.9%氯化鈉溶液中制成菌液,再取一環菌液在營養瓊脂平板上分區劃線,培養后可見單個菌落生長。

2.凡能產生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進行保種。孢子和芽胞的代謝作用較弱,但對惡劣環境有很強的抵抗。在傳代前,將菌液管放入80℃水浴中作用30分鐘,殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。 

3.定期對保藏菌種進行檢查、分離、純化,以防菌種變異及衰退,檢查項目包括菌落形態、染色、鏡檢、生化特性及血清學檢查。

4.選擇適宜的培養基及保藏方法。

二、常用菌種的保藏方法

1.普通瓊脂斜面  用于常用菌株的傳代。在營養瓊脂培養基內按0.5%加入瓊脂粉配制而成。接種培養后,將菌種管用硅膠塞塞緊,置4℃冰箱保存,每隔2~3個月傳種1次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡,其菌種須放25℃培養箱內保存。

2.半固體瓊脂  用于常用菌株的傳代。在營養肉湯培養基內按0.5%加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養后,置4℃冰箱保存,6個月傳種1次。如在培養管內加少量無菌液體石蠟隔絕空氣,減少水分蒸發,可延長菌種的保藏期。

3.真菌瓊脂斜面  用于真菌的傳代。在真菌培養基內按1.3%加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后,20~25℃培養24小時,置4℃冰箱保存,3~6個月傳種1次。

4.沙氏瓊脂斜面  用于真菌的傳代。配方:蛋白胨10g ,葡萄糖10g,瓊脂粉13g,加蒸餾水1000ml,待上述成分溶化后,搖勻分裝,115℃滅菌20分鐘,趁熱擺成斜面。劃線接種后,20~25℃培養24小時,置4℃冰箱保存,3~6個月傳種1次。 

5. 40%甘油水  用于細菌的傳代。配制方法:甘油40ml加水至100ml即成。分裝至試管內,每支2ml左右,121℃滅菌20分鐘備用。接種細菌后直接放4℃冰箱保存,6~12個月傳代1次。 

6.需氣菌、厭氣菌培養基  用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1ml至需氣菌、厭氣菌培養基15ml內,30~35℃培養18~24h,置4℃冰箱內保存3~6個月傳種1次。 

7. 皰肉培養基  用于破傷風梭菌的傳代。取破傷風梭菌CMCCB64067菌液0.1ml接種于皰肉培養基內,36℃±1℃厭氧培養3~4天,置4℃冰箱保存,6~12個月傳代1次。 

8. 液氮超低溫保藏法  適用于各類微生物的保藏。液氮溫度可達-196℃,此時菌種的新陳代謝活動已停止,但不會死亡。在配制好的菌液內加10%甘油作為保護劑,分裝于安瓿中,置液氮罐內可保存10年之久。

9.冷凍真空干燥保藏法  本法廣泛適用于各類微生物的保藏,包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護作用的介質內,分裝于滅菌菌種管內,速凍后抽真空,使菌液很快變為疏松的干燥菌粉,最后在真空狀態下密封管口,菌種保存期最長可達20年以上。

三、菌種檢查與復壯

菌種在傳代保藏過程中,易發生衰退、變異、污染和死亡,因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養基內使之復活,重新分離,純化形成單個菌落,再作菌種鑒定,包括菌落形態、顏色,染色性、鏡下觀察菌體形態等,必要時可做生化試驗及血清學反應。

菌種經人工傳代保藏過程中,由于自發突變而引起特性變弱或消失往往為菌種衰退。使衰退的菌種重新恢復原來的優良特性,稱為菌種復壯。常用方法有:

①分離純化:將菌種接種至營養肉湯培養基培養24小時,取菌液在營養瓊脂平板上分區劃線,培養后挑取典型單個菌落。 

②宿主復壯:將退化菌種接種到相應昆蟲或動植物宿主體內,傳種數代可恢復其原有的特性與毒力。

③抗逆復壯:通過極端的逆境處理使那些退化的細菌死亡,選育健壯的傳代保種。

四、實驗菌種的管理

菌種應放入專用冰箱,實行雙人、雙鎖保管。菌種應有購入記錄,傳代記錄,領用記錄和銷毀記錄。菌種應定期檢查、分離、純化,以防菌種變異及衰退。菌種傳代應不超過五代。 

五、細胞凍存與復蘇

細胞一旦離開活體開始原代培養,它的各種生物特性都將發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化,因此及時進行細胞凍存十分必要。

1.為避免污染造成的損失,在凍存細胞前,應該檢查細胞是否污染以及細胞的密度和細胞的活力。

2.細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,經實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞的活力。緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外減少細胞內冰晶的形成,從而減少由于冰晶的形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法,這樣可以保證細胞外結晶在很短時間內即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

3.操作步驟

(1)細胞凍存

a.配制含10%DMSO、10-20%小牛血清的凍存細胞培養液;

b.用胰蛋白酶將選好的細胞消化下來,消化時一定要掌握好消化的時間,如果時間處理不當,就會導致細胞的死亡,且細胞瓶中的胰酶殘留盡量倒干凈;

c.將消化好的細胞加入適量配制好的凍存培養液,用注射器或吸管輕輕吹打使細胞均勻;

d.將細胞懸液分裝入凍存管中,每管1~1.5ml;

e.在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;

f.凍存的過程:將凍存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱過夜,取出凍存管移入液氮容器內。

(2)細胞復蘇

a.佩戴厚點的手套,從液氮罐中取出凍存管快速直接放入37℃溫水中,并不時搖動使其在1分鐘內快速融解;

b.在無菌下從水浴中取出凍存管,凍存管用75%酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管或注射器吸出細胞懸液注入離心管中,由于離心管中細胞懸液較少所以再加入適量的培養液混勻;

c.離心,在1000rpm離心5min;

d.將離心管取出,棄去上清液,向離心管中加入含10%小牛血清細胞培養液用吸管或注射器吹打后接種于培養瓶,37℃培養箱靜止置培養;

f.7~8小時后換液繼續培養。

4.注意事項

(1)由于凍存的細胞還受其他因素影響,因此可能有部分死亡細胞,此時在換液時可將不貼壁和漂浮在培養液上已死亡的細胞輕輕倒掉,再補充新的培養液;

(2)凍存和復蘇細胞時最好用新配制的培養液;

(3)凍存管存取時一定要做好防護工作,以免凍傷。

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