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各國藥典對HPLC方法的規定

分類:
行業新聞
作者:
發布時間:
2019/12/20 14:37

所謂藥典方法,顧名思義,藥典專論所收載的方法,但是否每個人都知道,藥典方法考慮到各個實驗室的差異,有一定的可調范圍。

下面我們具體的來探討一下各國藥典對HPLC方法規定的差異吧!

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支,以液體為流動相,采用高壓輸液系統,將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內各成分被分離后,進入檢測器進行檢測,從而實現對試樣的分析。

中國藥典2015規定

0512高效液相色譜法規定如下:

品種正文項下規定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外,其余如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度(檢測器:塵埃粒子計數器、浮游菌采樣器等)等,均可適當改變,以達到系統適用性試驗的要求。

調整流動相組分比例時,當小比例組分的百分比例 X 小于33%時,允許改變范圍為0.7X ?1.3X ; 當X大于33%時,允許改變范圍為X —10%?X+ 10%。

由上文可知,中國藥典專論方法除填充劑種類、流動相組分(比例調整在規定范圍內)、檢測器類型不得改變外,其他條件改變了,還是認為是藥典方法。

但中國藥典沒有規定方法確認之說,所以,即使是中國藥典方法,也是應該按分析方法驗證的相關規定進行全套的方法驗證。

美國藥典41規定

USP41

為符合系統適用性的要求而調整的操作條件是允許的,除非專論項下另有規定,下面為所列的最大的可調范圍,這些調整需要額外的確認數據。

為確認新條件對方法的適用性,評估調整對相關分析性能特征存在的潛在影響。多條件的調整,將對系統性能產生累積影響,實施前需仔細考慮。

1、pH of mobile phase(HPLC): 流動性緩沖液的pH:±0.2 units,適用梯度及等度。

2、Concentration of salts in buffer (HPLC):  ±10%(pH允許情況下),適用梯度及等度。

3、Ratio of componentsin mobile phase (HPLC):流動相中組分(≤50%)可以在此比例上再調節±30%,且任一組分比例的調節不應超過±10%(相對于總的流動相),含三組分的流動相的調節可以分組分進行,含雙組分的流動相的調節可在最小的組分進行,雙組份和三組分的調節實例如下。

雙組分:例如流動相50:50,其中一組分50%的30%是15%,但是它超過了占總體比例±10%的規定,所以這個流動相比例的調節范圍應以±10%為限,可以在不超過40:60~60:40的范圍之間調節。再例如流動相比例為2:98,其中小組分2%的30%是0.6%,這個值不超過占總體比例±10%的規定,此流動相的比例可以在不超過1.4:98.6~2.6:97.4的范圍之間調節。

三組分:例如流動相60:35:5,它的次組分35%的30%是10.5%,但是它超過了占總體比例±10%的規定,所以這個流動相比例中的次組分的調節范圍應以±10%為限。對于最小組分5%的30%是1.5%??梢栽诓怀^50:45:5~70:25:5或58.5:35:6.5~61.5:35:3.5的范圍之間調節。

4、Wavelength ofUV-visible detector (HPLC):專論中規定的檢測波長不允許改變,檢測器供應商的程序或另一個驗證程序來說明,波長檢測誤差,最多不得超過±3nm。

5、Stationary phase

Column length (GC): 可以在±70%范圍內調節。

Column length (HPLC): 見粒徑項下。

Column inner diameter (HPLC): 如果線速度保持恒定,可以調整。見HPLC流速。

Column inner diameter (GC): 最大可調整至±50%。

Film thickness (capillaryGC): 最大可在?50% to100%調整。

6、Particle size(HPLC): 等度洗脫:粒度和柱長均可以修改,但柱長與粒度的比值(L/dp)恒定或在規定柱長與粒度的比值的-25%~+50%范圍內?;蛘撸ó斄6韧ㄟ^表面多孔顆粒調整時),其它柱長(L)和粒度(dp)的柱子可以使用,但理論塔板數N應在規定柱的-25%~+50%范圍內。

如果調節導致更高的理論塔板數時應注意,這樣將產生更小的峰容量,應通過縮小額外柱外峰拓寬的因素調整,例如儀器的管路、檢測器的體積、采樣速率和進樣體積。當專論中未規定粒度時,該比值應采用規定柱的最大粒度計算。

7、Particle size (GC): 如果色譜圖的符合系統適用性要求以及粒徑范圍比相同,粒度大小可以從大變小或從小變大,粒徑范圍比的定義是最大粒度直徑除以最小粒度直徑。

8、Flow rate (GC): 流速可以最大在±50%調整。(備注:如果專論中規定了線性速度參數,如果載氣系統可以按設置的控制,線性速度可以在 +50%~ ?25%范圍內調整)。

9、Flow rate (HPLC):當粒度改變時,流速也許需要調整,因為為達到相同的性能,小粒度的柱子需要更高的線速度(測量通過較少塔板高度),流速、柱內徑、粒度通過下面公式換算。

F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]

F1.................專論中規定的流速

F2..........................調整后的流速

dc1...........專論中規定的柱內徑

dc2...........使用的柱子的柱內徑

dp1......專論中規定的柱子粒度

dp2...................使用的柱子粒度

對于等度洗脫,如果粒度從≥3μm變化到<3μm時,將增加線速度(通過調整流速),如果柱效不下跌20%以上,相同地,如果粒度從<3μm變化到≥3μm時,應減少線速度(流速)來避免柱效降低20%以上。

梯度洗脫:流速、柱內徑、粒度將不允許調整。另外,流速可以在±50%調整。(只適用于等度洗脫)

歐洲藥典9規定

EP 2.2.46 ChromatographicSeparation Techniques 規定如下:

1、液相色譜-等度洗脫

(1)Composition of themobile phase:小組分的數量可以在相對±30%或絕對±2%范圍內調節,兩者取其大。(例如:流動相中次組分占10%,按相對±30%它的可調范圍在7%~13%,按絕對±2%它的可調范圍在8%~12%,取較大者7%~13%;再例如:次組分為5%時,按相對±30%它的可調范圍在3.5%~6.5%,按絕對±2%它的可調范圍在3%~7%,取較大者3%~7%),但須確保組分的絕對調節量不得超過10%。

(2)pH of the aqueouscomponent of the mobile phase:除非專論中另有規定,用于配制流動相的pH可以在規定的值或范圍的±0.2以內調節。如果待測品為非電離物質(中性物質),pH可在±1.0范圍內調節。

(3)Concentration ofsalts in the buffer component of a mobile phase:用于配制流動相的含水緩沖液的鹽的濃度可在±10%范圍內調節。

(4)Flow rate:一般調節范圍為±50%,若柱尺寸改變了,流速可以更大范圍內調節,具體可按下述公式來計算。

(5)Column parameters:

Stationary phase:固定相的屬性不能改變(例如:不能用C8來代替C18)。

particle size:最多可減小50%,不允許增加。

Column dimensions:長度可以±70%范圍內調節,內徑可在±25%范圍內調節。當柱的尺寸改變時,流速通過下面公式進行調節。

F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]

F1........專論中規定的流速,ml/min

F2................調整后的流速,ml/min

l1...............專論中規定的柱長,mm

l2...............使用的柱子的柱長,mm

d1..........專論中規定的柱內徑,mm

d2..............使用的柱子的內徑,mm

(6)Temperature:當專論中規定了柱溫時,可以±10℃范圍內調節,除非另有規定。

(7)Detector wavelength:不允許改變。

(8)Injection volume:若待檢峰的靈敏度和重復性好的話可以減小,不允許提高。

2、液相色譜-梯度洗脫

梯度洗脫的液相條件調節需比等度洗脫的更加慎重。

流動相的組成/梯度洗脫可以在符合下述條件的前提下進行小范圍的調節:

滿足系統適應性的條件;

主峰的出峰時間在原定保留時間的±15%以內;

流動相中最終組分的洗脫能力的強度不得弱于原規定組分;

如果系統適應性的條件達不到,則通常首選考慮滯留體積或更換柱子。

(1)Dwell volume滯留體積(死體積):儀器的結構將會大大的改變分離度、保留時間、相對保留時間,如果這些發生,是由于滯留體積過多。專論中通常在梯度洗脫時先進行等度洗脫??紤]到方法開發系統和實際系統的滯留體積的不同,所以梯度洗脫的時間應該足夠。所以使用者在進行方法確認時應確認等度洗脫的時間。如果洗脫時的滯留體積在專論中有規定,則開始洗脫的時間點(t min)應該被調節時間點(tc min)替代。用下面公式計算。

tc=t-(D-D0)/F

D....................................滯留體積,ml

D0........方法開發時的滯留體積,ml

F.......................................流速 ml/min

如果方法的驗證沒有包括該步驟,用于上述目的的等度的描述可以被省略。

(2)pH of the aqueouscomponent of the mobile phase含水相的流動相pH:不允許調節。

(3)Concentration of salts in the buffer component of a mobile phase流動相中緩沖液鹽的濃度:不允許調節。

(4)Flow rate流速:當柱子的內徑改變時,調節是可以接受的,具體見流速公式。

(5)Column parameters柱參數

Stationary phase固定相:固定相的屬性不能改變(例如:不能用C8來代替C18);

particle size粒徑,不允許調節。

Column dimensions柱尺寸:長度可以±70%范圍內調節,內徑可在±25%范圍內調節。當柱的尺寸改變時,流速按照下面的公式進行計算并調節。

(6)Temperature柱溫:當專論中的檢測方法規定了具體的柱溫時,溫度可在±5℃范圍內調節,除非另有規定。

(7)Detector wavelength檢測波長:不允許改變。

(8)Injection volume進樣體積:若待檢峰的靈敏度和重復性可滿足的話可以減小,不允許提高。

3、Gas chromatography氣相色譜

(1)Column parameters柱參數

Stationary phase固定相:粒徑最多可減少50%,不允許增加(填充柱)。膜厚可以在-50%~+100%范圍內調節(毛細管柱)。

Column dimensions柱尺寸:色譜柱長度可以±70%范圍內調節,色譜柱內徑可以在±50%范圍內調節。

(2)Flow rate流速(GC):可以在±50%范圍內調節。

(3)Temperature柱溫(GC):可以在±10%范圍內調節。

(4)Injection volumeand split volume進樣體積和分流比:若待檢峰的靈敏度和重復性可以滿足的話,可以調節。

USP與EP規定的可調范圍基本一致,相較于梯度洗脫,EP藥典更加謹慎,基本上不允許進行過多的調整。此外藥典方法,EP與USP均要求進行方法確認,并且明確指出,藥典方法可以不進行全套的驗證。

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